实时搜索: pcr模板浓度多少合适

pcr模板浓度多少合适

760条评论 1619人喜欢 1713次阅读 405人点赞
有浓度为1ug/ul的质粒A1,长度5000bp,其拷贝数为多少 ...

在荧光定量PCR中,如何由已知浓度和分子量的模板,求出拷贝数?: http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html试试这个网站,很不错的。直接给你算出来

【求助/交流】PCR扩增后没有条带是怎么回事?: PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。   模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。   酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。   引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。   Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。   反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。   物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。   靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。

恸哭,求助:PCR产物电泳一片涂抹带: 原因 建议
模板DNA,模板不纯:纯化模板或使用试剂盒提取DNA
耐热聚合酶,酶量过多:以0.5U为间隔适当减少酶量
Mg2+浓度,Mg2+浓度过高:适当降低Mg2+浓度,从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
dNTP,dNTP浓度过高:适当降低dNTP浓度
退火温度,退火温度过低:适当提高退火温度
PCR循环次数,PCR循环次数过多:减少PCR循环次数

ngs数据处理中如何去除由gc含量引起的pcr扩增偏好性: PCR需要注意以下事项:1.模板尽量避免含有酶抑制剂!2.引物保存时间不易过长,要符合引物涉及的原则,在用软件设计结束后要进行适当的人工处理。引物浓度要合适,太高容易引起错配及非特异性产物的形成。3.循环参数一般退火温度应低于Tm值5℃。先循环数次,然后延伸几分钟,再进行循环,有时候可以加大产物的量4.酶浓度过高容易导致非特异性产物的形成5.离子浓度过高容易导致非特异性产物的增加6.dNTP浓度过高会抑制酶的活性,引起错配希望对你有所帮助^_^

pcr条带单一 无杂带 可否直接纯化pcr产物: 1.镁离子浓度

Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。PCR中常用的体系应Mg2+浓度为1.5mmol/L,但对不同的反应体系应优化Mg2+浓度。浓度过高,使反应特异性降低;浓度过低,使产物产量减少。PCR反应中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.5-2.5mmol/L。最好对每种PCR反应体系Mg2+量的优化。另外,还需注意引物和模板DNA原液中是否含EDTA等螯合剂影响游离Mg2+的浓度。

2.三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

PCR反应中每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L,在此范围内,扩增产物量、特异性与合成忠实性这间的平衡最佳,dNTP浓度过低必然影响扩增产量,过高则会导致错误掺入,其浓度不能低于10-15μmol/L。由于dNTP的量还受其他因素的影响,所以不同反应体系中dNTP的最佳浓度不尽相同。

如何防止DNA电泳拖尾:

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差或酶的专一性不够,DNA模板量过大,dNTP浓度过高,Mg2 浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,模板长于3kd所引起。

减少酶量(一般以2单位Taq DNA聚合酶为基点,分梯度上下调一调,其他酶也差不多如此浓度,可以参考说明书);加强DNA聚合酶的专一性或调换另一来源的专一性更好的DNA聚合酶。

增加DNA聚合酶的专一性。

(1)改用专一性更强的DNA聚合酶,或者使用两种不同的DNA聚合酶,减低酶量或调换另一来源的专一性高的酶。更换DNA聚合酶时,酶量不要太大,以免出现特异性扩增。   (2)酶制剂中的甘油可能也是干扰因素。可以加入反应体系之前用超滤去除酶制剂中的甘油,若此操作引起酶的浓度过高,可以适当加双蒸馏水稀释。

(3)为了加强Taq DNA聚合酶的专一性。 的专一性,可在反应体系中加入:1-1.5mol/L的甜菜碱或者5%的DMSO可以提高PCR扩增效率,两者可以增加Taq DNA聚合酶的稳定性。

适当减少dNTP的浓度;减少dNTP的浓度一般需要与降低Mg2 浓度同方向偶联进行,但是不必按同样的比例。

适当降低Mg2 浓 度,可以采用梯度递减方式,以每次0.5mol/L递减,但是Mg2 的终浓度不要低于1.0mol/L。

缩短PCR反应的退火温度时间或调高复性温度。没有重新设计引物之前,不要大范围地变动反应体系的复性温度,要在引物的Tm少5-10度的范围内变动。如果出现非特异性扩增,则在引物的Tm少5-10度的范围内把PCR反应的复性温度提高1-3度。

使用梯度降低PCR。在以基因组DNA为模板进行PCR扩增时,非特异性扩增较多,这时,最初的退火温度选用比Tm高5-10度。然后每隔1个循环,退火温度降低1-2度,直至到达正常的Tm附近的退火温度。

采用使用专一性更强的梯度降低PCR、热启动PCR和巢式PCR。使用热启动模式。使用热启动时可以购买商用的PCR热启动酶,也可以用石蜡隔离模式。巢式PCR也有现成的试剂盒可以购买。

保证PCR反应的DNA模板的质量,要用电泳检测一下分子量和纯度,质量不好则要重新提取和纯化DNA模板;适当增加DNA模板量,减少循环次数。

以上措施都不行时,最后就只能重新设计引物,加强引物的专一性。

适当减少DNA模板量。

适当减少循环次数,一般也就循环25次就差不多了。

求助:PCR扩增失败的原因: 一 、模板质量问题:
1)模板提取不完整,其中不含你的目的基因,或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA,PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题,可以增加模板量试试,但不一定行得通。
2)模板里面残留某种试剂成份,可能抑制Taq聚合酶的活性,如果是这种情况,可以用试剂盒把模板再纯化一下,或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。
3) 为什么跑电泳会出现拖带呢?
1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关,其中就有一个是电压,在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率,但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。
2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后 ,按1:50 或1:100 等稀释后,再当成模板扩一次怎么样。
二 、引物问题
1)样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好,而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利!
2)普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了,为正常的三倍只要引物特异性比较好,那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话,也许会扩出来非特异带。
在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr,没关系的三Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。
三、Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。
四、模板浓度过低。
五、退火温度过高。有可能,可以做个梯度PCR试一下。
六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。
七、dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高,适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA(dNTP消耗一半),所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20~30%,即底物抑制。
八、PCR产物电泳
1.电泳图不清晰,可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。
marker都出问题说明是你的胶的问题,或者电泳操作的问题。
2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。

PCR反应引物浓度多少合适(工作液),储备液浓度多少?: 储备液一般是100uM,也有稀释成10uM的。反正做PCR的最终其工作液终浓度范围是0.2μmol/L左右。我一般把引物稀释成10uM,25微升PCR体系一般加0.4-1.0微升的引物。

  • 云油是什么

    可可小姐黑色香水100ml保质期多长时间: 三到五年。你放心买,香奈儿香水不用担心保质期的,只要平时注意保存就好了。时间可以更长。用完用保鲜膜封好放冰箱冷藏,可以以免挥发和让保质期更长。 ...

    491条评论 5250人喜欢 4272次阅读 284人点赞
  • pps为什么下载不了

    我买的永和豆浆补钙吗?: 豆浆含有一定的钙元素,但是不会太多,你要补钙可以买他们家高钙的豆浆粉,那个钙含量高。 ...

    532条评论 2932人喜欢 1680次阅读 288人点赞
  • 360如何多开

    大家100ml的爽肤水一般会用多久: 这个要看你使用的量还有一天中使用的次数,一般正常的话能用2-3个月左右。望采纳。 ...

    491条评论 2528人喜欢 6636次阅读 484人点赞
  • 昆明哪里酒吧好玩

    豆浆牛奶哪个更补钙?千万别进误区: 缺钙和补钙也是我们多次提及到的事情,青少年缺钙会使个人发育不健康,成年人缺钙会使人易得骨质疏松症,无论哪一种都是不妙的事。现在很多人都在努力地补钙,几乎所有的方法都被人尝试过,但我不得不负责人地告诉你,其实某些你平时...

    449条评论 2398人喜欢 6394次阅读 991人点赞
  • 17款宝骏730几个颜色

    豆浆里面含钙高还是牛奶里含钙高?具体含钙量多少?: 每100克豆浆营养素含量:热量(大卡)14.00 碳水化合物(克)1.10 脂肪(克)0.70 蛋白质(克)1.80 纤维素(克)1.10 维生素A(微克)15.00 维生素E(毫克)0.80 胡萝卜素(微克)90....

    633条评论 4506人喜欢 2779次阅读 346人点赞